分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长(λ)为横坐标，吸收强度(A)为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法;用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
    近年来，紫外及可见光分光光度分析已得到广泛的应用，它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析，而且还可以用于某些物质含量的测定。
   
    分光光谱技术可用于:
    通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成。
    通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量。
    通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，追踪反应过程。
   
    分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束。实际上从这种单色一种产生的光不是某个波长的光，而是一段窄的带宽上的光，带宽是分光光度计的一个重要特性，这是由于它决定了吸收测量中所用的波长--普通分光光度计的带宽为5~10nm，用于研究的仪器的带宽小于因为光栅夹缝的宽度影响着带宽，带宽随光栅夹缝的宽度的减少而降低，要获得特定波长下的精确数据，尽可能使用最小的缝宽度。然而，减少了缝宽也会减少到达监测器的光度，降低了信/噪比。缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性于离散光的存在。

分光光度计的定量分析:
    假如已知一种物质在某一波长下的吸光率(通常是该物质的最大吸收值，这时灵敏度最高)，这种物质纯溶液的浓度可用比尔-朗伯关系式算出。摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下，比色杯厚度为1cm时的吸收值。该值可以从光谱数据表中查到，也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线。这样，在所要求的浓度范围内，便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系，该直线的斜率即为摩尔吸光系数。
    比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时，比色杯厚度为1cm时测定的吸光值。该值对于未知分子质量的物质如蛋白质核酸的测定很有用，这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示。使用公式Log10(Io/I)=，l[C]时，比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值。
    这种简单的方法不能用于测定混合样品。在这种情况下，也许可以通过测量几个波长下的吸光度来估算每种成分的含量，如可用此方法在核酸存在下进行蛋白质含量的估算。